16S rDNA测序实验

• 简要描述： 通过细菌16S rRNA基因可变区测序分析微生物群落组成。

• 基本原理：

  • 保守引物扩增16S rRNA基因V3-V4区（341F: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'; 805R: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）→ 高通量测序 → 聚类OTU/ASV分析物种丰度。

• 操作步骤 (Illumina平台)：

  1. 样本处理：

  • 环境样本：土壤/粪便用PowerSoil Kit提取DNA

  • 样本要求：DNA总量≥10 ng，无抑制剂

  2. PCR扩增：双步法扩增（带barcode接头）

  3. 文库构建：磁珠纯化 → 文库定量（Qubit）

  4. 上机测序：MiSeq PE300模式（≥50,000 reads/样本）

  5. 生信分析：

  • QIIME2/DADA2流程

  • α多样性（Shannon指数）

  • β多样性（PCoA分析）

• 应用范围：

  • 肠道菌群失调研究

  • 环境微生物多样性监测

• 注意事项：

  • 避免人为污染（设阴性对照）

  • 扩增循环数≤35（防嵌合体）