KI小鼠模型 (Knock-In 小鼠模型)

• 简要描述： 通过同源重组或CRISPR/Cas9等技术，将特定的外源DNA序列（如点突变、报告基因标签、人类化基因序列）精确地插入到小鼠基因组的内源位点，替换或插入到目标基因中，实现内源基因的改造或报告。

• 基本原理： 利用细胞自身的同源重组修复机制（HDR）或CRISPR/Cas9介导的HDR：

  1. 设计含有目标序列（突变/标签）和两侧同源臂（与目标位点两侧序列同源）的打靶载体或供体DNA模板。

  2. 在ES细胞或受精卵中，通过电穿孔/显微注射引入打靶载体/供体DNA以及可能需要的核酸酶（如CRISPR/Cas9组件在目标位点制造双链断裂DSB）。

  3. DSB会触发细胞利用引入的同源模板进行修复，从而将目标序列精确“敲入”到内源位点，取代原有序列或插入特定位置。

• 操作步骤 (简述):

  1. 设计与构建： 设计并构建打靶载体（含同源臂、目标序列、筛选标记）或单链/双链寡核苷酸供体（ssODN/dsODN）。

  2. 基因编辑：

     • ES细胞途径： 打靶载体电转入ES细胞，药物筛选（如G418抗性）阳性克隆，PCR/Southern验证。阳性ES细胞注入囊胚，获得嵌合体小鼠，与野生型交配获得生殖系传递的杂合子（KI/+）。

     • 受精卵注射途径（CRISPR首选）： 将Cas9 mRNA/sgRNA（靶向目标位点）和供体DNA模板共同显微注射到受精卵原核/细胞质。移植假孕母鼠，出生后鉴定Founder小鼠。

  3. 小鼠繁育： 将阳性Founder或F1杂合子（KI/+）小鼠互交获得纯合子（KI/KI）。

  4. 基因型鉴定： PCR、测序、Southern blot等确认敲入成功且无误。

• 应用范围：

  • 精确引入人类疾病相关点突变（如亨廷顿病CAG重复扩增）。

  • 基因“人源化”（用人类基因序列替换小鼠同源基因）。

  • 在基因内插入报告基因（如GFP, LacZ）进行内源表达模式研究或蛋白定位。

  • 构建条件性等位基因的基础（如loxP-flanked exon）。

  • 研究基因调控元件（如启动子、增强子）的功能。

• 注意事项：

  • 效率与脱靶： CRISPR/Cas9效率较高但存在脱靶风险；传统ES打靶效率低但精准。需进行深度测序脱靶分析。

  • 同源臂长度与设计： 影响HDR效率，需优化。

  • 筛选标记去除： 打靶载体中的筛选标记基因（如neo）可能影响邻近基因表达，常需通过Flp/cre切除。

  • 表型分析： 需全面分析纯合子和杂合子表型，评估敲入对内源基因功能的影响（可能造成功能缺失LOF或功能获得GOF）。

  • 背景品系： 遗传背景影响表型，需注意或进行回交。